霉毒素B原料一及白酒中1的酿酒改进测定黄曲方法

在国标GB5009.22—2016方法1：同位素稀释液相色谱-串联质谱法的酿酒基础上进行了方法优化、改进，原料建立了酿酒原料及白酒中黄曲霉毒素B1（AFTB1）的及白酒中进分析方法。样品经甲醇∶水（7∶3）提取后，黄曲净化稀释液由TritionX-100的霉毒PBS改为超纯水，黏度变小、测定方易于通过萃取小柱。法改流动相改为甲醇和0.02%甲酸-2mmol／L乙酸铵，酿酒提高了响应强度。原料梯度洗脱，及白酒中进经高效液相色谱分离，黄曲在ESI正离子模式下扫描，霉毒进行多反应监测模式（MRM）检测。测定方

结果表明，法改仪器精密度良好，酿酒不同浓度标液相对标准误差（RSD%）均<6%；所绘制校准曲线线性关系良好，0.05～10µg／L范围内相关系数r值>0.999；方法定量限为0.05µg／kg，检出限<0.01μg／kg，均低于其他检测方法。原料与白酒的加标回收率都在90%～105%，完全符合要求。此方法检出限低、准确度高，加强了企业对AFTB1的严格监控。

白酒酿造原料主要有高粱、大麦、小麦、豌豆等，因酿酒原料用量较大，酒厂一般对原料批量购买，进行存储使用，一旦购买原料存在安全隐患或存储不当造成霉变，将产生一些对人体有害的霉菌毒素类物质，其中黄曲霉毒素B1（AFTB1）对人体健康的危害最大，为强毒性、强致癌性物质，已被世界卫生组织癌症机构（IARC）列入一级致癌物。

为了严格控制黄曲霉毒素对人体的危害风险，从而保障消费者的安全，美国、日本、加拿大等多个国家已发布了有关黄曲霉毒素最大限定量的规定，我国GB2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》标准中也规定了粮食中的真菌毒素B1的最大限量，凤香型酿酒原料（高粱、大麦、小麦、豌豆）中的最大限量分别为10µg／kg、5µg／kg、5µg／kg、5µg／kg。尽管如此，但仍然存在一定的风险，因此建立准确、高效的检测方法尤为重要。

目前对于黄曲霉毒素的检测方法主要有液相色谱-荧光检测法、酶联免疫吸附筛查法、高光谱检测法、薄层色谱法、同位素稀释液质联用法等。本研究建立了酿酒原料及白酒中AFTB1的液质联用（HPLC-MS／MS）检测法。该方法样品前处理较简单、检测效率高、准确度高、检测限更低，进一步满足了消费者对食品安全更高的期望和国家对食品检测更严的要求。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

样品：原料（高粱、大麦、小麦），成品酒取自于陕西西凤酒股份有限公司。

试剂：甲酸、乙腈、甲醇、乙酸铵（分析纯）、超纯水。

仪器设备：高效液相色谱串联质谱仪，万分天平，氮吹仪，免疫亲和柱。

标准品：黄曲霉毒素B1（AFTB1纯度≥98%），同位素内标13C17-AFTB1（纯度≥98%）。

1.2标准溶液的配制

AFTB1标准储备液：称取AFTB1为1.0mg，用乙腈定容至100mL容量瓶，配制成10µg／mL标准储备液。

同位素内标13C17-AFTB1工作液：准确移取0.5µg／mL的13C17-AFTB10.8mL，用乙腈定容至10mL，配制成40ng／mL的同位素内标工作液。

AFTB1系列标准工作液：移取AFTB1标准储备液1.0mL至100mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成100ng／mL的AFTB1中间标准液。再分别移取AFTB1中间标准液5µL、10µL、50µL、100µL、200µL、500µL、800µL、1000µL至10mL容量瓶中，分别加500µL的40ng／mL同位素内标工作液，用初始流动相定容，配制成浓度为0.05ng／mL、0.1ng／mL、0.5ng／mL、1.0ng／mL、2.0ng／mL、5.0ng／mL、8.0ng／mL、10.0ng／mL的系列标准工作液，过0.22µm滤膜，待上机。

1.3仪器参数条件

液相条件：色谱柱：Shin-packXR-ODSIIIC18（2.0mmI.D*150mmL.，3.0μm）；进样量：10µL；流动相：A：0.02%甲酸-2mmol／L乙酸铵，B：甲醇；柱温：40℃；流速：0.3mL／min；驻留时间：10ms。洗脱方式：梯度洗脱，见表1。

质谱条件：扫描方式：多级反应监测（MRM）；离子源：ESI，正离子模式；加热块温度：450℃；DL温度：250℃；雾化气流速：3.0L／min；干燥气流速：15L／min；离子源接口电压+4.5；驻留时间：10ms。

1.4试验方法

1.4.1样品提取

酿酒原料：准确称取酿酒原料5g样品于50mL离心管中，加入250µL同位素内标工作液，旋涡振荡混匀，加入20mL甲醇-水（70+30），涡旋混匀，静置30min后用均质器均质3min，过玻璃纤维滤纸。准确移取滤液4mL加入12mL的超纯水，混合均匀，待净化。

酒样：称取2g酒样，加入100µL同位素内标工作液，加入4mL水，振荡混匀，待净化。

1.4.2净化

原料：待免疫亲和柱保护液流尽后加入上述溶液，以1滴／s的流速通过免疫亲和柱，流完后用2×10mL超纯水淋洗免疫亲和柱，自然重力流干后挤干小柱，准确加入2×0.5mL甲醇洗脱，再加1mL水挤干，收集于比色试管中，过0.22µm有机滤膜，待上机。

酒样：待免疫亲和柱保护液流尽后加入1.4.1中酒样溶液，自然重力下滴，流完后加10mL去离子水淋洗柱子，挤干；加2×0.5mL甲醇洗脱，再加1mL水挤干，收集于比色试管中，过0.22µm有机滤膜，待上机。

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